风疹诊断标准及处理原则――附录B

发布时间:2011-08-26 共1页

  血清学诊断方法
  B1 血凝抑制试验
  B1.1 原理
  鹅红细胞(或鸽红细胞)上有风疹病毒受体,遇风疹病毒可产生凝集现象。若将抗体与病毒(血凝素)预先温育后再加入红细胞则不产生凝集,称为血凝抑制。定量血凝素与不同稀释度抗体(血清)作用后能完全抑制血凝的最高血清稀释度,即为血凝抑制抗体效价。
  B1.2 主要材料
  B1.2.1 血凝板:6×12或8×12个圆形孔(孔底光滑)的U形板。
  B1.2.2 定量移液器:定量移液器选用25μL(即0.025mL)。
  B1.2.3 尖底小试管:形如离心管,便于血清的吸取。
  B1.3 风疹血凝素的制备
  取毒种感染BHK21细胞或Vero细胞,常规换液培养。末次换入2%牛血清199综合培养基,置33℃培养6~7天以上,待细胞病变十十十时收获,冻化,取上清液用Tween-80乙醚处理即为血凝素;如用白陶土处理的2%牛血清配制感染细胞的培养基来制备血凝素,则不用Tween-80乙醚处理。
  B1.4 血凝滴度
  所用溶液一律置4℃预冷,微量塑料板法。血凝素用葡萄糖-明胶-巴比妥缓冲液以1∶2倍比递增稀释,再加0.25%新鲜鹅红细胞(或鸽红细胞)悬液,混匀,置4℃至少1h,观察结果,以“++++”(4单位)的最高稀释度为血凝滴度。
  B1.5 血凝抑制试验
  原血清0.1mL+0.7mL氯化锰肝素液,4℃作用20min后在1∶8稀释的血清中加1滴积压鹅红细胞(或鸽红细胞),1h内摇2~3次,置4℃过夜,再以2000r/min的速度离心10min,取上清液待检。待检血清用pH6.2的葡萄糖-明胶-巴比妥缓冲液倍比稀释后,每孔加0.025mL血凝素(含4单位;如系pH9的血凝素,事先应用0.1mol/L盐酸调至pH6.2左右再用)。抗原抗体在4℃作用1h后加入0.25%鹅红细胞1滴(0.025mL),在4℃下作用2h后判定结果,以完全抑制血凝为终点。每次试验预设以下对照:
  阳性血清对照:应出现一定已知效价
  阴性血清对照:应出现阴性结果
  待检血清对照:应无非特异性凝集
  抗原对照:应出现+++++(4单位)、+++(2单位)、++~+(1单位)、±(1/2单位)的凝集现象
  血球对照:应为阳性
  HI抗体阳性标准判定以1∶16作为阳性标准。
  葡萄糖-明胶-巴比妥缓冲剂(DGV)配制:
  巴比妥 0.58g
  巴比妥钠 0.38g
  明胶 0.6g
  无水CaCl2 0.02g
  MgSO44H2O 0.12g
  NaCl 8.5g
  葡萄糖 10g
  巴比妥与明胶可分别先各在250mL蒸馏水中加温溶解,然后依次加入其他药品,溶解后加双蒸水至1000mL,分装10瓶消毒。用前以0.1mol/L盐酸将pH调至6.2,用于稀释待测血清、配制血凝素及红细胞。
  氯化锰-肝素液配制
  MnCl2 3.96g
  肝素 16万单位
  加双蒸水至100mL,使用时以双蒸水稀释4倍(1∶3)。
  B2 酶联免疫吸附法检测风疹IgG抗体(ELISA间接法)
  B2.1 原理
  将风疹抗原包被于固相载体上,加上待检血清,再用酶标抗抗体间接检出特异性抗体。
  B2.2 材料
  B2.2.1 聚苯乙烯酶标板。
  B2.2.2 风疹阴性和阳性血清。
  B2.2.3 风疹抗原。
  B2.2.4 抗入IgG辣根过氧化物酶结合物。
  B2.2.5 酶底物邻苯二胺-双氧水。
  B2.3 操作程序
  B2.3.1 用pH9.6碳酸盐缓冲液稀释风疹抗原与未感染风疹病毒的细胞抗原(对照抗原)。
  B2.3.2 于40孔聚苯乙烯板的单排孔与双排孔分别加入0.1mL/孔的风疹抗原与对照抗原。右下最后一孔不加任何抗原作为空白对照,4℃过夜。
  B2.3.3 以0.05%Tween 20生理盐水(NS-T)洗板三次,倒去洗液。
  B2.3.4 在血凝板中以2%牛血清NS-T将待测血清稀释成1:20~1:1280四个稀释度,每个稀释度加风疹抗原与对照抗原各1孔(0.1mL,下同),轻轻振摇后置37℃1~2h.
  B2.3.5 以NS-T洗三次,倒去洗液后每孔加入以2%牛血清NS-T稀释的抗人IgG辣根过氧化物酶结合物0.1mL(空白对照不加),置37℃1~2h。
  B2.3.6 以NS-T洗三次,倒去洗液后加邻苯二胺-双氧水底物液,每孔0.1mL(包括空白对照孔),避光在37℃放置10~20min,随时观察,待对照孔开始显淡黄色时即用2mol/L硫酸终止,每孔加50μL。
  B2.3.7 用空白对照孔调零点,以酶标仪(492nm)测定各孔OD值。OD值不足0.05者按0.05计。凡同一稀释度下风疹抗原孔OD值/对照抗原孔OD值>2.1即P/N为阳性。阳性之最高稀释度的倒数即为该血清的抗体效价。小于1∶20者视为阴性。
  B2.3.8 每次实验应作已知效价的阳性及阴性血清对照。
  B3 酶联免疫吸附法检测风疹IgM抗体(抗体捕捉ELISA法)
  B3.1 原理
  利用包被在固相载体上的抗人IgMμ链抗体,捕捉待检血清中的IgM,再用风疹病毒抗原和已知的酶标风疹病毒抗体去检测血清中IgM是否为抗风疹抗体。利用底物使酶显色而测知。
  B3.2 材料
  B3.2.1 聚苯乙烯40孔或96孔板。
  B3.2.2 抗人IgMμ链抗体。
  B3.2.3 风疹病毒抗原和正常对照抗原。
  B3.2.4 抗风疹病毒抗体(单克隆或多克隆)。
  B3.2.5 酶标抗抗体:抗风疹病毒抗体和酶标抗抗体也可用酶标抗风疹病毒抗体代替。
  B3.2.6 酶底物-邻苯二胺及双氧水。
  B3.2.7 已知的风疹IgM抗体阳性和阴性血清。
  B3.2.8 包被液:0.05mol/L碳酸盐缓冲液(PH9.6)
  无水碳酸钠 159mg
  碳酸氢钠 293mg,使用不超过2周
  蒸馏水 加至100mL
  B3.2.9 洗涤液(NS-T):0.85%盐水的吐温液
  氯化钠 17g
  吐温 201.0mL
  蒸馏水 加至2000mL
  B3.2.10 稀释液为5%牛血清的NS-T液。
  B3.2.11 邻苯二胺-过氧化氢底物液
  先配柠檬酸磷酸缓冲液(PH5.0):
  磷酸氢二钠 18.41g
  柠檬酸 5.1g
  蒸馏水 加至1000mL,分小瓶冰冻保存
  临用时配底物液:
  邻苯二胺(OPD)4mg
  柠檬酸磷酸缓冲液10mL
  30%双氧水 5mL
  B3.3 操作
  B3.3.1 包被抗人IgMμ链抗体,每孔100μL。
  B3.3.2 4℃过夜,倒掉液体,用10%牛血清NS-T液120μL封闭。
  B3.3.3 37℃1h后倒去封闭液,洗三次。
  B3.3.4 加待测血清(1∶100稀释,即1μL待测血清加100μL稀释液),每孔100μL.每份血清加2孔(或4孔),37℃2h后洗三次。
  B3.3.5 加风疹抗原于1孔(或2孔)中,每孔100μL;另1孔(或2孔)中加正常对照抗原,4℃过夜后,洗三次。
  B3.3.6 加风疹单克隆抗体每孔100μL,37℃1.5h后倒去抗体,洗三次。
  B3.3.7 加酶标记的抗鼠抗体,每孔100μL,37℃1.5h后倒去抗鼠抗体,洗4次,扣干。
  B3.3.6与B3.3.7两步,亦可用加酶标抗风疹单克隆(或多克隆)抗体一步所取代,每孔加100μL,37℃水浴2h,洗三次再扣干。
  B3.3.8 加底物邻苯二胺-双氧水,每孔100μL,37℃10~20min。
  B3.3.9 加终止酶的反应液即2mol/L硫酸,50μL/孔,判定结果。
  B3.4 结果的判定
  B3.4.1 肉眼判定法:待检血清与风疹抗原孔呈明显的棕色反应,正常对照抗原孔不(或微)显色,两者能用肉眼明显察觉者即为阳性。
  B3.4.2 用酶标仪的492nm光源测OD值,血清的P/N≥2.1时为阳性(P为待测血清与风疹抗原作用的OD值,N为待测血清与正常对照抗原作用的OD值)。
  在用待测血清与已知风疹阴性血清对比时,则P为待测血清与风疹抗原作用后的OD值,N为标本阴性血清与风疹抗原作用后OD值。整理

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