第八章 基因工程及其在医药工业中的应用
一、学习目的与要求
本章阐述基因工程相关的酶学、载体以及基因工程的流程，重点是重要工具酶和载体、重组DNA的流程等。学习本章要求掌握基因工程相关的酶学、基因工程的载体、目的基因制备和常用分离方法、载体DNA与目的基因的连接、重组分子引入受体细胞、重组细胞的筛选鉴定、克隆基因在大肠杆菌的表达；熟悉克隆目的基因在酵母中表达、重组原核微生物生产药物；了解基因工程的诞生、原理和发展。
二、课程内容
第一节 基因工程的诞生、原理和发展
第二节 基因工程相关的酶学
1. 核酸限制性内切酶与 DNA 分子体外切割：宿主控制的限制与修饰现象——细菌自我保护机制；核酸内切酶的命名与类型；II型核酸限制性内切酶的基本特性
2. DNA 连接酶：大肠杆菌 DNA 连接酶；T4 DNA连接酶
3. 聚合酶：大肠杆菌 DNA 聚合酶I（E.coli pol I）；Klenow 聚合酶；T4噬菌体DNA多聚酶；经修饰的 T7 噬菌体 DNA 聚合酶（测序酶）；Taq DNA 聚合酶；逆转录酶
4. DNA 和 RNA 的修饰酶：末端脱氧核昔酸转移酶与同聚物加尾；T4 多核昔酸激酶与 DNA 分子 5‘末端标记；碱性磷酸酶与 DNA 脱磷酸作用
5. 核酸酶：核酸酶S1 与 RNA 分子定位；BAL31核酸酶与确定限制位点；外切核酸酶 III；脱氧核糖核酸酶I；核糖核酸酶A
第三节 基因工程的载体
1. 大肠杆菌载体：克隆载体；穿梭载体；表达载体
2. 真核细胞载体：哺乳动物细胞的病毒载体；酵母载体；杆状病毒载体
第四节 目的基因制备和常用分离方法
1. 基因克隆和分离的基本步骤：选择含目的基因实验材料的原则；选择合适的载体制备目的 DNA 片段并克隆；选择合适的检测方法筛选目的基因
2. 人工合成： DNA 的化学合成过程；化学合成寡聚核昔酸可通过以下几种方法连接成完整的基因；化学合成寡聚核昔酸的应用；采用化学酶促相结合的办法；人工合成基因的基本程序；人工合成基因的局限性
3. 基因文库构建（限制性内切酶法）：原核生物的目的基因直接分离；鸟枪法克隆基因；真核生物基因文库的建立
4. cDNA文库构建（逆转录法）：构建理想的 cDNA 文库需要考虑的因素；构建 CDNA 文库的步骤
5. PCR法：基本原理；PCR 反应控制要点；PCR扩增的应用；PCR 分类
第五节 载体DNA与目的基因的连接
1. DNA分子间连接策略：粘性末端DNA片段连接；平末端DNA片段连接；粘平末端DNA片段间连接
2. 影响目的基因与载体之间连接效率的因素：DNA片段间的连接方式；目的基因与载体 DNA 的浓度和比例；连接温度与时间；其他因素
第六节 重组分子引入受体细胞
1. 重组 DNA 导入大肠杆菌：氯化钙转化法；转染法
2. 抗生素生物合成基因引人链霉菌载体宿主系统：抗生素生物合成基因引人的途径；链霉菌的宿主转化系统
3. 酵母菌转化：完整细胞转化法；原生质体转化法
4. 重组 DNA 导人哺乳动物细胞：显微注射法；DNA－磷酸钙转染法；DEAE 葡聚糖转染法；阳性脂质体及其介导的基因转染；电穿孔法；病毒感染法
第七节 重组体的鉴定和分析
1. 生物学方法：表型筛选法；噬菌斑形成筛选法；遗传互补法——利用遗传选择标记筛选哺乳动物转基因细胞；利用报告基因筛选植物转化细胞
2. 核酸分子杂交法：菌落原位杂交；DNA印迹分析；RNA印迹分析；斑点印迹杂交和狭线印迹杂交
3. 免疫分析筛选
4. 限制性内切酶图谱的鉴定
5. 双脱氧终止法测序（Sanger法）
第八节 克隆基因在大肠杆菌中表达策略
1. 真核基因在原核细胞中表达的特点
2. 影响外源基因在大肠杆菌中高效表达的因素：优化构建表达载体；影响转录水平的调控；影响翻译水平的因素；影响蛋白质水平的因素；其他因素
3. 真核基因在大肠杆菌中的表达类型：融合蛋白的表达；非融合蛋白的表达；蛋白分泌型表达
4. 表达蛋白提取、纯化和鉴定：提取；纯化；真核基因在大肠杆菌中表达产物的检测与鉴定
第九节 克隆目的基因在酵母中表达
1. 常用宿主
2. 酵母表达载体特点
3. 在酵母中高效表达外源基因的策略
4. 酵母表达系统的应用
第十节 重组原核微生物生产药物
1. 生产小分子药物：重组合成维生素C；重组合成抗生素
2. 生产蛋白类药物
3. 基因工程疫苗：乙肝病毒的结构；乙肝表面抗原的巴斯德毕赤酵母重组菌的构建
三、考核知识点
（一）基因工程的诞生、原理和发展
（二）基因工程相关的酶学
（三）基因工程的载体
（四）目的基因制备和常用分离方法
（五）载体DNA与目的基因的连接
（六）重组分子引入受体细胞
（七）重组体的鉴定和分析
（八）克隆基因在大肠杆菌中表达策略
（九）克隆目的基因在酵母中表达
（十）重组原核微生物生产药物
四、考核要求
（一）基因工程的诞生、原理和发展
（二）基因工程相关的酶学
识记：基因工程各种工具酶的生物学特性
领会：II型核酸限制性内切酶的基本特性
应用：基因工程中常用的工具酶有哪些？它们在基因工程中的用途为何？
（三）基因工程的载体
识记：载体的概念和种类
领会：大肠杆菌克隆载体、表达载体的结构
应用：试述基因工程常用载体的种类和用途。
（四）目的基因制备和常用分离方法
识记：基因克隆和分离的基本步骤；基因文库与cDNA文库的构建方法；PCR的原理。
领会：PCR 反应控制要点；PCR扩增的应用
应用：① 目的基因制备方法有哪几种，它们各自的优缺点？② 试述PCR的原理。
（五）载体DNA与目的基因的连接
识记：DNA分子间连接策略。
领会：影响目的基因与载体之间连接效率的因素。
（六）重组分子引入受体细胞
识记：转化、转导、转染的概念。
领会：重组分子引入受体细胞的常用方法。
（七）重组体的鉴定和分析
识记：重组体的鉴定的常用方法。
领会：双脱氧测序法的原理。
（八）克隆基因在大肠杆菌中表达策略
识记：真核基因在原核细胞中表达的特点。
领会：表达蛋白提取、纯化和鉴定的方法。
应用：影响外源基因在大肠杆菌中高效表达的因素有哪些？
（九）克隆目的基因在酵母中表达
识记：酵母表达载体特点。
领会：在酵母中高效表达外源基因的策略。
应用：酵母表达系统在基因工程中有哪些应用？
（十）重组原核微生物生产药物
